Kính hiển vi đồng tiêu

Bách khoa toàn thư mở Wikipedia
Bước tới: menu, tìm kiếm

Kính hiển vi đồng tiêu (confocal microscopy) là kính hiển vi quang học tạo ảnh bằng phương pháp quét, có thể tạo ảnh hai chiều, ảnh ba chiềuảnh bốn chiều (thêm thời gian).

Khái niệm[sửa | sửa mã nguồn]

Kính hiển vi đồng tiêu sử dụng kỹ thuật kính hiển vi quang học/huỳnh quang có khả năng tăng độ phân giải của hệ quan sát nhờ sử dụng lỗ hội tụ (pinhole) và chùm sáng quét được hội tụ vào một điểm nhỏ trên mặt phẳng tiêu (point illumination). Ánh sáng phản xạ sẽ tạo lại hình ảnh của vật, được ghi lại bởi các CCD camera trong đa số kính hiển vi đồng tiêu hiện nay với độ phân giải tới khoảng 100 nm ở độ phóng đại 1500 lần hoặc thấp hơn nữa, vượt xa các kính quang học truyền thống vốn bị giới hạn bởi hiện tượng nhiễu xạ (200 nm). Gần đây, kính hiển vi đồng tiêu đang được phát triển rộng rãi trong các ngành khoa học vật liệu, nghiên cứu y sinh, khoa học tế bào, bán dẫn...Confocal Microscopes: ANDOR,Leica Microsystems

Hoạt động[sửa | sửa mã nguồn]

Nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang

Kính hiển vi đồng tiêu về bản chất là một dạng tân tiến hơn của kính hiển vi huỳnh quang (fluorescence microscope)[1]. Điểm khác biệt là kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải lớn hơn nhờ sử dụng các lỗ hội tụ để loại đi các ánh sáng không hội tụ hoàn toàn (out-of- focus) và chùm tia được quét trên mẫu vật (do kích thước mũi chùm tia được hội tụ rất nhỏ). Mẫu vật thường được nhuộm bởi các chất huỳnh quang (fluorophores) như cyanine, DAPI hay các protein tổng hợpwww.fluorophores.tugraz.at/.

Chùm sáng sơ cấp được phát ra từ các đèn halogen, đèn thủy ngân hoặc điốt quang năng lượng cao (high-power LED) với các kính hiển vi đồng tiêu truyền thống (confocal microscopy) hay từ các đèn laser trong các kính đồng tiêu quét laser (laser scanning confocal microscopy). Đôi lúc là ánh sáng trắng được cho đi qua các tấm lọc màu (filter) để lựa chọn ánh sáng đơn sắc có màu sắc cần thiết, thường từ 680 nm (đỏ và hồng ngoại), 550 nm (xanh lá cây), 480 nm (xanh dương) cho tới 280 - 400 nm (dải cực tím). Việc lựa chọn bước sóng cho phép tạo ra sự huỳnh quang ở các loại fluorophores khác nhau www.physics.emory.edu/~weeks/confocal/. Ánh sáng sơ cấp được cho đi qua một lỗ hội tụ sơ cấp để loại bỏ các tia bị cầu sai (spherical abberation) hoặc kém hội tụ (out-of-focus).Sau đó, ánh sáng đi qua một gương lọc/bán mạ (dichroic mirror) và được hội tụ tại một điểm rất nhỏ trên mặt phẳng tiêu của mẫu vật, với độ sâu trường ảnh (depth-of-field) vào khoảng vài trăm nanomet (do vậy tạo ra được ảnh ba chiều của mẫu vật)www.microscopyu.com. Ánh sáng phản xạ hoặc ánh sáng huỳnh quang (ánh sáng thứ cấp) sẽ được phản chiếu tại gương lọc (do có bước sóng dài hơn bước sóng cho phép của gương), đi qua thêm một pinhole loại ánh sáng out-of-focus thứ hai trước khi đi vào bộ phận ghi ảnh. Các kính hiển vi đồng tiêu có thị kính quan sát như kính quang học truyền thống, nhưng có thể được trang bị các CCD camera hoặc CMOS để ghi ảnh, đặc biệt cần thiết vì mắt người mẫn cảm và không quan sát được tia laser hay tia cực tím [2].

Hình ảnh cuối của vật là ảnh ba chiều (khác với kính quang học truyền qua truyền thống là ảnh hai chiều). Ở các phiên bản đặc biệt, các kính hiển vi đồng tiêu được gắn thêm các máy đo thời gian cực nhanh để ghi ảnh bốn chiều của vật (cỡ nano giây tới mili giây) cho các ứng dụng đo thời gian của các hoạt động tế bào (time-lapse microscopy).

Lịch sử[sửa | sửa mã nguồn]

Vào năm 1957, Marvin Minsky đã nhận bằng sáng chế cho lý thuyết về kính hiển vi đồng tiêu. 21 năm sau đó, tức vào năm 1978, Thomas và Christoph Creme đã thiết kế một kính hiển vi đồng tiêu quét laser để ghi ảnh ba chiều của mẫu vật. Trong thập kỷ kế tiếp, kính hiển vi huỳnh quang quét laser được hoàn thiện bởi Trường Đại học Amsterdam và Phòng Thí Nghiệm Sinh học Phân Tử Châu Âu (European Molecular Biology Laboratory - EMBL) và được thương mại hóa vào những năm sau đó với các bộ phận cải tiến, biến thể và dần trở nên nhỏ gọn hơn, độ phân giải tốt hơn.

Biến thể[sửa | sửa mã nguồn]

Nhằm mục đích tăng độ phân giải của các kính hiển vi đồng tiêu, rất nhiều biến thể thuộc dạng quang học siêu phân giải (superresolution) đã được tạo ra dựa trên kính hiển vi đồng tiêu - huỳnh quang và các kính quang học truyền thống. Một số ví dụ bao gồm:

  • Kính hiển vi 4Pi (bốn Pi) hoặc I5M

Là một biến thể đơn giản của kính hiển vi đồng tiêu - huỳnh quang, sử dụng một tinh thể calcite để tách chùm sáng sơ cấp làm hai chùm riêng biệt, được hội tụ từ hai vật kính khác nhau đặt ở hai mặt trên và dưới mẫu vật (hoặc hai bên). Tia phản xạ được ghi lại bởi CCD camera hoặc CMOS. Thiết kế này nhằm mục đích tăng gấp đôi chỉ số khẩu độ (numerical aperture) và do đó, tăng độ phân giải lên gấp đôi (từ 100 - 150 nm, bằng một nửa so với kính hiển vi truyền thống).

  • Kính hiển vi đa mặt phẳng tiêu (Multifocal microscopy)

Sử dụng hai chùm tia lọc màu khác nhau để ghi ảnh ở hai mặt phẳng khác nhau.

  • Kính hiển vi huỳnh quang phản xạ toàn phần (Total internal reflection fluorescent microscopy - TIRF microscopy)

Kính hiển vi này sử dụng một thấu kính Thạch Anh góc 180 độ để tạo ra hiện tượng phản xạ toàn phần khi có chùm tia sơ cấp chiếu tới, đặt ngay bên trên hoặc bên dưới mẫu vật. Ánh sáng kích thích được chiếu tới mẫu vật từ một góc 45 độ (1/4 góc 180 độ)và phản xạ cũng ở góc đó. Tia sáng phản xạ được ghi nhận với độ phân giải khoảng 100 nm.

  • Kính hiển vi STED (Stimulated Emission Depletion microscopy - kính hiển vi làm nghèo bức xạ)

Kính hiển vi STED có thể tạo ra ảnh với độ phân giải rất cao (khoảng 40 - 60 nm, kết hợp với Ground State Depletion - GSD - làm nghèo năng lượng gốc có thể tạo ra độ phân giải từ 5 - 7.8 nm) nhờ việc dùng một tia laser màu đỏ để làm nghèo tia laser ghi ảnh (thu nhỏ kích thước của chùm tia kích thích) do đó giảm kích thước chấm huỳnh quang.

Và rất nhiều các kỹ thuật khác như kính hiển vi hấp thụ đa photon (multiphoton microscopy), chiếu sáng có hệ thống (structured illumination), phản xạ giao thoa (interference reflection microscopy), kính hiển vi tái dựng cấu trúc (stochastic reconstruction microscopy - STORM), kính hiển vi huỳnh quang ánh sáng phẳng (light-sheet fluorescence microscopy), định vị phân tử kích hoạt bằng ánh sáng (Photoactivated Localization Microscopy - PALM)...

Ứng dụng, Ưu điểm và nhược điểm[sửa | sửa mã nguồn]

Kính hiển vi đồng tiêu là một dụng cụ quang học cho phép vượt xa khả năng quan sát của các kính hiển vi truyền thống, do đó được áp dụng để quan sát các chi tiết vốn quá nhỏ để quan sát bởi các kính hiển vi quang học thông thường (dưới 200 nm). Các ứng dụng hiện nay bao gồm các ngành y sing học (nghiên cứu tế bào), bán dẫn (quan sát vật liệu ở dạng ảnh ba chiều)...

Kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải cao mà kết cấu và điều khiển không quá phức tạp, giá thành rẻ hơn các kính hiển vi điện tử nhưng độ phân giải tốt hơn nhiều so với kính hiển vi quang học thông thường, có thể xuống tới dưới 10 nm ở các biến thể hoặc ở độ phóng đại trung bình (1500 lần, càng phóng đại, độ phân giải càng giảm), đồng thời có độ sáng rất cao và phân biệt tốt các chi tiết nhờ sử dụng các chất nhuộm màu. Khả năng ghi ảnh ba chiều và đo thời gian của kính hiển vi đồng tiêu cũng là một lợi điểm, cho phép nghiên cứu "chiều cao" của các chi tiết trong mạch bán dẫn hay thời gian hoạt động của các tế bào sống (các hoạt động nội bào, phân chia hoặc phát triển), đồng thời không yêu cầu phải phá hủy mẫu vật. Một ưu điểm nữa của kính hiển vi đồng tiêu là tốc độ quét nhanh (cỡ mili giây) nếu so với các kỹ thuật quét khác như kính hiển vi điện tử truyền qua quét (cỡ giây), kính hiển vi điện tử quét (cỡ vài chục giây tới vài chục phút) và kính hiển vi quét đầu dò (cỡ vài chục phút)Nikon MicroscopyU | Confocal Microscopy.

Nhược điểm của kính hiển vi đồng tiêu là giá thành, mặc dù rẻ hơn so với các loại biến thể hay kính hiển vi điện tử hay kính hiển vi quét đầu dò, nhưng vẫn ở mức khá đắt (trên 5,000 đôla Mỹ tùy vào loại biến thể và các thiết bị phụ trợ) tức khoảng 105 triệu VND so với kính hiển vi quang học thông dụng từ 16 đến dưới 80 triệu VND. Một điểm kém khác là yêu cầu các chất nhuộm màu cho quá trình quan sát các phần tử không phát xạ huỳnh quang nguyên sinh như nhân tế bào, DNA, RNA, vi khuẩn, virut... Điều này làm ảnh hưởng tương đối lớn đến giá thành của thiết bị và hoạt động, đồng thời trong một số trường hợp không thích hợp cho các mẫu vật sống (mặc dù đa số trường hợp đều có thể áp dụng với tế bào sống)Nikon MicroscopyU | Confocal Microscopy Vả lại, khả năng phân giải của kính hiển vi đồng tiêu, dù được liệt vào loại tốt, vẫn còn thua xa các thiết bị quan sát hiện đại hơn như kính hiển vi điện tử hay kính hiển vi quét đầu dò (có khả năng phân giải tới cấp đơn phân tử, nguyên tử)www.microscopyu.com. Một số biến thể của kính hiển vi đồng tiêu có khả năng phân giải được các protein và virus (10 - 100 nm).

Liên kết ngoài[sửa | sửa mã nguồn]